PCR是分子生物學(xué)研究極其重要的工具，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，基本原理是在試管中模擬細胞內的DNA復制，即人為創(chuàng )造核酸半保留復制條件，使目的DNA在細胞外完成擴增的過(guò)程，它可被看作是生物體外的特殊DNA復制。
PCR也叫基因擴增儀，主要用于用于科研及臨床的基因擴增、定性PCR基因擴增、熒光/酶免終點(diǎn)定量DNA基因擴增、基因芯片等其他基因分析應用的基因擴增等?；驍U增儀適合國內外各種PCR試劑盒傳染病類(lèi)、腫瘤類(lèi)、科研類(lèi)。進(jìn)口基因擴增儀主要由外殼、變溫反應腔、散熱系統、加熱系統、制冷系統、電子控制系統、供電系統、人機界面等各部分組成?；驍U增儀廣泛應用于各級各類(lèi)醫療機構、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業(yè)及乳品廠(chǎng)等。
“基因擴增儀”的誕生和發(fā)展
核酸體外擴增的設想最早是由Khorana在1971年提出的?！敖?jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過(guò)程便可合成tRNA基因?！?/span>
然而當時(shí)還沒(méi)有成熟的基因序列分析方法，也沒(méi)有熱穩定DNA聚合酶以及引物合成操作很困難。這種設想達不到實(shí)際的效果。并且在70年代初出現了分子克隆技術(shù)，一種克隆和擴增基因的途徑被提供了，因此人們遺忘了Khorana的設想。
1983年4月的一個(gè)星期五晚上，Kary Mullis開(kāi)車(chē)去鄉下別墅的路上,猛然閃現出“多聚酶鏈式反應”的想法；
1983年12月，Mullis用同位素標記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長(cháng)度的diyi個(gè)PCR片段；
1985年，Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測序工作，卻常為沒(méi)有足夠多的模板DNA而煩惱；
1985年10月25日申請了PCR的專(zhuān)利，1987年7月28日批準（專(zhuān)利號4,683,202 ），Mullis是diyi發(fā)明人；
1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了diyi篇PCR的學(xué)術(shù)論文，Mullis是共同作者；
1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗室做專(zhuān)題報告，全世界從此開(kāi)始學(xué)習PCR的方法。
根據PCR原理，商業(yè)公司在PCR儀的基礎功能上不斷進(jìn)行創(chuàng )新和改進(jìn)。至今，PCR儀已經(jīng)更新至第三代技術(shù)。為方便讀者朋友理解，本文將對三代PCR儀的原理、特點(diǎn)、主要廠(chǎng)商及產(chǎn)品、應用領(lǐng)域做一系統梳理。
第一代——標準PCR儀
▲ 標準PCR反應過(guò)程
標準PCR儀也叫做終點(diǎn)PCR儀，是指目的基因僅經(jīng)過(guò)預變性、變性、退火、延伸階段產(chǎn)生大量的核酸序列的PCR儀，PE-Cetus公司推出的世界上第一臺PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀屬于此種。根據PCR退火溫度和擴增條件(細胞內/外)，標準PCR又可以分為三類(lèi)：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。
第二代——qPCR(實(shí)時(shí)定量PCR)
1996年Applied Biosystems(現被賽默飛收購)公司推出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTFQ PCR)技術(shù)，并發(fā)明了世界上第一臺熒光定量PCR儀，開(kāi)始了從定性到定量的跨越。
實(shí)時(shí)定量PCR儀是指在PCR反應體系中加入能夠指示DNA片段擴增過(guò)程的熒光染料(SYBR Green等)或熒光標記的特異性的探針(TaqMan Probe等)，在普通PCR儀設計基礎上增加熒光信號激發(fā)和采集系統和計算機分析處理系統，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器，通過(guò)對PCR過(guò)程中產(chǎn)生的熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR過(guò)程，再結合相應的計算機軟件對所獲得的熒光信號數據進(jìn)行分析，計算待測樣品特定DNA片段的初始濃度。
目前根據熒光信號反應樣品濃度主要有兩種方法：
1.Taqman探針?lè )?/span>
探針兩端分別為報告熒光基團R和熒光淬滅基團Q，當探針完整時(shí)，R發(fā)出的熒光被Q吸收，檢測不到熒光信號。探針隨機結合到DNA單鏈上，PCR擴增時(shí)，探針被水解，R與Q分離，R發(fā)出的熒光就會(huì )被檢測到。每擴增一條DNA鏈都會(huì )生成一個(gè)熒光分子。
2. SYBR Green Ι染料法
SYBR Green Ι是一種只有在和雙鏈DNA結合時(shí)才會(huì )發(fā)熒光的染料。在PCR變性時(shí)，無(wú)熒光產(chǎn)生，到了復性和延伸階段則能檢測到熒光信號。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要應用于病原體檢測、藥物療效考核、腫瘤基因檢測、基因表達研究、轉基因研究、單核苷酸多態(tài)性(SNP)及突變分析等細分研究方向，廣泛應用于臨床醫學(xué)檢測、生物醫藥研發(fā)、食品行業(yè)等研究領(lǐng)域。
第三代——dPCR(數字PCR)
不同于qPCR 對每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測定的方法，數字 PCR 技術(shù)是在擴增結束后對每個(gè)反應單元的熒光信號進(jìn)行采集。
數字PCR是一種基于PCR反應(聚合酶鏈反應)的單分子絕對定量技術(shù)。如圖1，在數字PCR的過(guò)程中：
(a) PCR反應體系(含有熒光染料或探針)被分割為數以萬(wàn)計的均一微液滴，
(b) 其中部分微液滴內會(huì )含有一個(gè)或多個(gè)模板，
(c) 將這些微液滴收集到試管內進(jìn)行PCR反應，其中含有模板的微液滴會(huì )產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，由此具有較強的熒光，成為陽(yáng)性微液滴，
(d) 在PCR反應完成后，依次對每個(gè)微液滴內的熒光進(jìn)行檢測，
(e) 根據微液滴信號的峰值高度，繪制出微液滴熒光分布的散點(diǎn)圖，
(f) 通過(guò)合理的熒光分類(lèi)閾值將微液滴內的熒光強度數字化，判斷出其中具有較強熒光的陽(yáng)性微液滴(圖1f中綠色的數據點(diǎn)，稱(chēng)為“1”)和具有較弱熒光的陰性微液滴(圖1f中藍色的數據點(diǎn)，稱(chēng)為“0”)，并通過(guò)“1”和“0”的個(gè)數來(lái)實(shí)現絕對定量。因此，與實(shí)時(shí)定量PCR不同，數字PCR不需要使用標準曲線(xiàn)，即可直接對核酸拷貝數的絕對值進(jìn)行定量。
▲ 數字PCR原理示意圖
最后通過(guò)直接計數或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。
迄今為止，目前市面上常見(jiàn)的數字PCR儀器主要有兩種，根據微反應的形成原理不同，主要分為 “芯片數字PCR”與“微滴數字PCR”兩類(lèi)。
1.芯片數字PCR
▲ 芯片數字PCR原理圖
2.液滴數字PCR
▲ 微液滴數字PCR原理圖
液滴數字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技術(shù)，即將DNA模板與連接引物的磁性微球以極低的濃度(比如單拷貝) 包裹于油水兩相形成的納升至皮升級液滴中進(jìn)行 PCR 擴增，擴增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，收集破乳后進(jìn)行測序。通過(guò)油水兩相間隔得到的以液滴為單位的 PCR 反應體系，比微孔板和 IFC 系統更容易實(shí)現小體積和高通量，而且系統簡(jiǎn)單，成本低，因此成為理想的數字PCR技術(shù)平臺。
數字PCR技術(shù)主要應用于不穩定性分析、腫瘤早期研究、產(chǎn)前診斷、致病微生物檢測、癌癥標志物稀有突變檢測等研究領(lǐng)域，也用于驗證NGS中的低頻突變、 DNA甲基化檢測、突變多重檢測等方向。
“基因擴增儀”的結構和原理
1、結構
外殼、供電系統、電子控制系統、加熱系統、制冷系統、散熱系統、變溫反應腔、外殼以及人機界面等共同構成了基因擴增儀。
2、原理
PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴增，加熱使雙鏈DNA解開(kāi)螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復 “變性→退火→引物延伸”過(guò)程至25～40個(gè)循環(huán)，呈指數級擴大待測樣本中的核酸拷貝數。
3、基因擴增的基本要素
基因擴增的基本要素與DNA復制的基本要素是一致的。
①DNA模板：待拷貝的DNA稱(chēng)為模板，它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA，Z后擴增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。
②引物：是DNA復制的先鋒，就象結晶過(guò)程中的晶核，引導DNA的合成。在PCR擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)：是DNA復制的動(dòng)力，在dNTP等底物存在時(shí)在引物的引導下沿著(zhù)模板DNA合成互補的DNA鏈。
④緩沖液：提供DNA合成反應所需的pH，離子強度等環(huán)境。
⑤4種單核苷酸：dNTP，提供DNA合成原料。
4、基因擴增儀原理
基因擴增儀是利用PCR技術(shù)對特定基因做體外的大量合成，用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。
PCR反應一般設置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板。PCR的擴增效率很高，如果循環(huán)次數是30次，那么新生DNA片段理論上達到230拷貝(約為109個(gè)分子)。PCR反應每個(gè)循環(huán)的三個(gè)基本反應步驟如下：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備;
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。到達平臺期所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。
“基因擴增儀”的用途和分類(lèi)
基因擴增儀的用途
基因擴增儀靈敏度高，操作起來(lái)簡(jiǎn)便、快捷，加上對特定基因樣本純度要求低，因而被廣泛地運用在以下檢測活動(dòng)中:
1、醫學(xué)和健康檢驗機構臨床診斷，用于判斷檢體中是否會(huì )表現某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷以及基因復制。
2、DNA鑒定，常見(jiàn)于司法鑒定領(lǐng)域。
3、臨床分子診斷試劑和生物試劑公司藥品研發(fā)。
4、轉基因、微生物、動(dòng)物源性成分檢測，常見(jiàn)于醫藥衛生及農產(chǎn)品檢驗領(lǐng)域。
基因擴增儀的分類(lèi)
1. 普通的PCR儀
一次PCR擴增只能運行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，又叫傳統的PCR儀。
用途：主要是做一些簡(jiǎn)單的、對單一退火溫度的目的基因進(jìn)行擴增。
a.梯度PCR儀：一次PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常為12種溫度梯度的普通PCR儀。
用途：研究未知DNA退火溫度的擴增。
b.原位PCR：將具有細胞定位能力的原位雜交技術(shù)運用于從細胞內靶DNA的定位分析，在細胞內實(shí)現基因擴增的普通PCR儀。
用途：用于在細胞的靶DNA所在位置上進(jìn)行基因擴增。
2. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀
PCR擴增時(shí)加入的引物利用熒光素進(jìn)行標記，使引物和熒光探針同時(shí)與模板進(jìn)行特異性結合，擴增結果通過(guò)熒光信號采集系統實(shí)時(shí)采集信號并輸送到計算機分析處理系統，實(shí)時(shí)輸出量化結果，這樣的PCR儀叫實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
a.金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀
可作為普通PCR儀使用，可帶梯度功能，可容納的樣本量大，無(wú)需特殊耗材，溫度均一性欠佳，有邊緣效應，標準曲線(xiàn)的反應條件難以做到與樣品完全一致
b.離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀
溫度均一性較好，使用的是同一個(gè)激發(fā)光源和檢測器，隨時(shí)檢測旋轉到跟前的樣品，有效減少系統誤差?？扇菁{樣品量少，有的需用特殊毛細管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能
c.各孔獨立控溫的定量PCR儀
“基因擴增儀”操作規程
普通PCR儀操作規程
1、開(kāi)機操作
（1）將PCR儀電源開(kāi)關(guān)打開(kāi)。
（2）將PCR儀頂蓋向后平推，然后將PCR薄壁管放進(jìn)去。
（3）將PCR儀頂蓋向前平推，并且均勻用力壓下反扣部分。
值得注意的是：9700PCR儀必須使用圓頭的PCR薄壁管。
2、關(guān)機操作
（1）實(shí)驗結束后，點(diǎn)擊EXit到主界面出現，將PCR電源開(kāi)關(guān)關(guān)閉。
（2）均勻用力抬起反扣部分，將PCR儀頂蓋向后平推，將PCR薄壁管取出。
（3）將PCR儀頂蓋向前平推。
熒光定量PCR儀操作規程
1.開(kāi)始運行儀器
將PCR儀底座開(kāi)關(guān)打開(kāi)，再將定量PCR儀檢測器開(kāi)關(guān)打開(kāi)。在實(shí)驗之前，首先對系統預熱半個(gè)小時(shí)，打開(kāi)電腦，將iQ5軟件啟動(dòng)。
2.放置樣品
在0.2ml的薄壁管或96孔板內加入PCR反應體系，將管蓋蓋上，注意，不要讓手指和反應管表面有接觸，所以必須將一次性塑料手套戴上。按照順序在儀器的加熱孔中放入反應管。
3.設置程序，運行試驗
定量PCR軟件的基本操作步驟如下：
（1）對熱循環(huán)程序文件進(jìn)行設置。
（2）對反應管文件進(jìn)行設置。
（3）點(diǎn)擊“run”鍵，將程序運行。
（4）數據分析
4.結果分析
（1）PCR反應結束后，標準曲線(xiàn)和Ct值軟件會(huì )自動(dòng)計算。
（2）可以在軟件窗口選擇相應的分析功能進(jìn)行表達量分析，等位基因分析。
（3）點(diǎn)擊右上方的“Report”鍵，還能夠將結果報告單輸出。
5.關(guān)閉運行儀器
實(shí)驗結束后將iQ5軟件、熒光定量檢測器及擴增系統電源關(guān)閉，將電腦關(guān)閉，將反應管取出。
“基因擴增儀”的常見(jiàn)問(wèn)題及故障
常見(jiàn)問(wèn)題
1.為什么在不同型號的PCR儀上擴增出的條帶亮度有差異？
答：不同的PCR儀有不一樣的優(yōu)化的升降溫策略，因此當向另一類(lèi)PCR儀轉移這類(lèi)CR儀上使用的PCR步驟參數上時(shí)，需要進(jìn)行試驗優(yōu)化。
2.在PCR實(shí)驗結束后我的樣品可以一直放在PCR儀中低溫保存嗎？
答：Z好不要，建議在程序運行結束之后，應當將樣品從PCR儀中及時(shí)取出。當低溫保存時(shí)，盡量設定比較高的溫度，能夠使得儀器的使用壽命延長(cháng)。
3.模擬管和樣品臺控溫模式有什么差別？
若采用樣品臺控溫模式，當將樣品臺升降溫到目標溫度時(shí)，因為傳熱延遲，樣品管內樣品達到目標溫度仍需要較長(cháng)的時(shí)間，因此，當步驟時(shí)間在30s以下時(shí)，Z好使用模擬管控，若要使用樣品臺控溫模式，那么Z好延長(cháng)一倍步驟時(shí)間。
4.反應后反應管壁出現液滴？
可能原因1：在程序運行前，熱蓋加熱功能沒(méi)有被開(kāi)啟。
方法：將熱蓋加熱功能開(kāi)啟。
可能原因2：在反應結束后，過(guò)長(cháng)時(shí)間的低溫保存。
方法：在結束運行后，熱蓋將自動(dòng)關(guān)閉，因此會(huì )出現冷凝，這不會(huì )影響實(shí)驗的結果，在離心機上放置反應管，瞬時(shí)離心使液滴回到管子底部就行。
5.使用的微孔板，反應后反應液有明顯蒸發(fā)？
方法：
（1）保證使用的微孔板質(zhì)量很好，在反應之前，要密封嚴格。
（2）保證熱蓋蓋緊，將熱蓋的溫度適當提高。
（3）將反應體積增大。
6.使用PCR管，反應后部分PCR管內反應液有明顯蒸發(fā)？
方法：
（1）確保使用的PCR管質(zhì)量很高。
（2）將四個(gè)同樣的空PCR管分別置于樣品臺的四角，從而使證熱蓋壓在各PCR管上的壓力均勻得到保證。
常見(jiàn)故障
1.加熱或者冷卻速度緩慢
出現這樣的情況，原因可能是控制器或機械故障，需要運行診斷測試并記錄加熱速率。
2.開(kāi)機時(shí)，出現錯誤信息
這種情況有可能是儀器某一系統啟動(dòng)失敗或者電壓太低造成的。確保同一電路中沒(méi)有使用其他電器，不要在已有用電器電路上增設線(xiàn)路。
3.打開(kāi)電源然而儀器不響應
出現這種情況，很可能是因為插座沒(méi)有插緊或者電源線(xiàn)脫落，只要重新插入電源就行。
4.屏幕不顯示并且馬達和風(fēng)扇不啟動(dòng)
出現這種情況，很有可能是總保險絲被熔斷，只要將保險絲更換就能使故障排除。
5.插上電源屏幕空白或，按下某鍵屏幕不顯示相應畫(huà)面
出現這樣的情況，很可能是邏輯電路或者電源的保險絲被熔斷，也有可能是因為控制器，對保險絲進(jìn)行更換，如果不能恢復正常，那么就咨詢(xún)維修工程師。
“基因擴增儀”維護保養及注意事項
盡管PCR儀器不是計量?jì)x器，然而其的作用原理和基本計量要素有很密切的關(guān)系，因此，PCR儀需要定期檢測和維護。
儀器的維護保養
1．樣品池的清洗
首先將蓋子打開(kāi)，然后在樣品池加入95%乙醇或10%清洗液，浸泡5min，然后對被污染的孔進(jìn)行清洗，使用微量移液器對液體進(jìn)行吸取，使用棉簽將剩余液體吸干。打開(kāi)PCR儀，設定保持溫度為50℃使PCR程序運行，揮發(fā)去除殘余液體，通常只需要5-10分鐘左右。
2.熱蓋的清洗
對于熒光定量PCR儀，若出現熒光污染，并且樣品池不是這一污染的來(lái)源，或者當熱蓋的松緊受到污染或殘跡物的影響時(shí)，墊蓋底面需要用壓縮空氣或純水清洗，使樣品池的孔干凈，無(wú)污物阻擋光路得到保證。
3.儀器外表面的清洗
對儀器的外表面進(jìn)行清洗能夠使灰塵和油脂除去，然而不能達到消毒的效果，對PCR儀的外表面進(jìn)行清洗Z好選擇沒(méi)有腐蝕性的清洗劑。
4．更換保險絲
首先關(guān)掉PCR儀，將插頭拔取，將電源插口旁邊的保險盒打開(kāi)，將備用的保險絲換上，觀(guān)察是否恢復正常。
儀器的維護和保養的注意事項
1)PCR儀器需要視制冷方式而定通常進(jìn)行半年至少一次定期檢測。
2)PCR反應的要求溫度與實(shí)際分布的反應溫度不相同，如果通過(guò)檢測，與設置溫度相比較，各孔平均溫度差超過(guò)1～2℃，那么可以對PCR實(shí)際反應溫度差運用溫度修正法來(lái)糾正。
3)升、降溫過(guò)程的時(shí)間控制是PCR反應過(guò)程的關(guān)鍵時(shí)間越短越好，如果PCR儀的降溫過(guò)程高于1分鐘，那么就應該對儀器的制冷系統進(jìn)行檢查。當PCR儀是使用風(fēng)冷制冷時(shí)，其反應底座的灰塵要較徹底地清理，若是其他的制冷系統，那么應該對相關(guān)的制冷部件進(jìn)行檢查。
4)通常情況下，如果儀器的溫度能夠采用溫度修正法糾正，那么不要輕易地對儀器的電子控制部件打開(kāi)或調整。
山東博科-基因擴增儀
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